导读：
东方富海博士后创新实践基地秉承研究发现价值、研究引领投资的理念，对投资实务进行前瞻性研究。我们特别设立了“富海洞察”专栏，用于发布基地系列研究报告，供交流探讨。本文是mRNA的相关研究，为基地出品的第十五篇报告。
以mRNA为基础研发药物和疗法已经历了数十年的发展，新冠mRNA疫苗的成功更是将mRNA技术的关注度提到了空前的高度。mRNA技术凭借其原理的先进性，理论上可以生产出任何人类所需的蛋白质，因此，不管是在疾病预防还是治疗领域，其产生的社会价值和商业价值都是其他技术无可比拟的。
过去的几十年，是mRNA技术积累的过程，而未来的十年，将是行业蓬勃发展的大时代。
mRNA药物与传统药物不同，既不是化学小分子也不是生物大分子，而是体内细胞制造蛋白质的“指挥官”。DNA通过转录（Transcription）的方式在体内产生成熟的mRNA，而后mRNA从细胞核进入细胞基质当中与核糖体结合完成翻译过程，实现蛋白质的生产，最终蛋白质在细胞内外执行相应的具体功能。
▲mRNA的转录和翻译过程
mRNA被称为“万能钥匙”，理论上能够表达任何蛋白质，可以探索治疗几乎所有基于蛋白质的疾病。其技术的应用领域主要分为免疫疗法、蛋白质替代疗法和再生医学疗法。在新冠疫苗研发中，mRNA 技术首次得到产业化验证，重点体现出其蛋白表达能力强、研发周期短的独特优势。目前mRNA技术已逐步推进至蛋白替代疗法、细胞治疗等领域，其未来产业化应用场景十分丰富。
1mRNA技术的发展历史
从发展历程来看，mRNA从发现到首个产品上市用了接近 60 年的时间，可以分为三个阶段。
第一阶段为发现认识期，从1961年mRNA的发现，到1990年全球首次发表动物体内描述体外转录mRNA的研究，明确了mRNA的具体机制和作用。
第二阶段为技术积累期，从上世纪90年代到2019年，mRNA技术处于快速技术积累阶段，2009年实现首次在人体上应用的癌症免疫治疗，2010年Moderna成立，2015-2019年，LNP递送技术以及核酸序列修饰技术的逐渐成熟给mRNA行业发展铺平了道路。mRNA药物的基本技术路线确定。
第三阶段为快速发展期，2020年mRNA新冠疫苗问世，成为首个上市的mRNA技术产品，mRNA技术三巨头也于2019年前后上市，我国的mRNA技术行业也于此开始蓬勃发展，随着前期的技术积累逐渐成熟以及资本市场的助力，未来的十年会是mRNA技术大放异彩的时期。
▲mRNA技术的发展历史
2mRNA技术的应用领域
mRNA技术可以使用在非常多的治疗领域中，比如肿瘤免疫、预防性疫苗、过敏的免疫脱敏治疗、蛋白替代疗法和再生医学等领域。
▲mRNA技术的应用领域
美国科学家Rosa等人总结了早期mRNA技术在临床上的探索过程。mRNA的临床探索开始于2003年，至今利用mRNA技术来解决不同疾病的临床试验已经超过140多项，其中癌症领域和预防性疾病领域的临床实验数量最多。
目前来看预防性疫苗和肿瘤免疫治疗在 mRNA 技术中预计的上市时间是最快的。截止到2022年12月，我们统计了全球三大mRNA企业：Moderna、BioNTech和CureVac的已上市产品和已经进入临床阶段的在研管线，其中预防感染性疫苗类共计10个项目，肿瘤免疫治疗类共15个项目，其他应用领域合计只有3个进入临床。同时进入临床II期以上的项目共9个，相对来说成熟的品种仍然较少，行业正处在快速发展的阶段。
从三大巨头的在研管线可以看到，目前仅免疫疗法和蛋白替代疗法有项目进入临床II期，再生细胞疗法在研管线少且均处于早期阶段，行业的关注点主要还是在传染病预防性疫苗和肿瘤免疫治疗这两个应用场景。
3mRNA技术要点
技术路线决定产品形态，产品形态决定应用方向。从某种意义上来说，mRNA的技术基础决定了mRNA能在哪些赛道获得应用。
mRNA技术由三大部分组成：mRNA技术、核酸递送技术和mRNA制剂生产技术。
mRNA技术
mRNA的序列结构决定了所表达蛋白的结构、免疫原性及稳定性。目前蛋白质基因测序的技术已经比较成熟，较为关键的是如何在得到氨基酸序列后设计出最优的mRNA核苷酸序列。
▲影响mRNA功能的关键要素和结构
除了蛋白序列影响mRNA药物最终的情况外，mRNA的非编码区也对mRNA的表达效率有重要的影响。
主要有四个部分会影响mRNA的效率：
1) 5’端的帽子结构
根据中国生物工程杂志上胡瞬等人的研究，Cap结构可以通过与真核翻译起始复合物eIF4F结合影响 mRNA 的翻译效率。目前mRNA的加帽途径主要有两种。
第一是通过基于重组痘苗病毒的加帽酶的转录后修饰，此方法可以合成传统的帽子结构，Cap0、Cap1和Cap2，由于帽子结构mRNA 5’端没有游离的末端磷酸基团，所以可以降低mRNA降解的风险。同时Cap1、2 mRNA后面两个核苷酸上的甲基分别封闭了磷酸酯键上游离的2’OH基团，因而对RNA酶A、T1、T2都很稳定。
第二是在体外转录过程中添加cap类似物，此方法更为通用、简便和便宜，并且可以将各种修饰的帽结构进行多样化设计，但此方法中有部分竞争性cap类似物会导致mRNA不完全加帽，同时部分cap类似物会反向定位到mRNA的末端。由此抗-反转帽子类似物(ARCA) 诞生可以确保mRNA具有更高的翻译效率。在ARCAs中也可进行几种类型的结构修饰，包括将三磷酸桥的氧分子化学取代为硫、硼烷、硒、亚甲基或NH-类似物提高对脱帽酶的抵抗力。有研究表明，经过修饰的ARCA帽比ARCA帽的mRNA稳定性提高了1.28倍，对比未加帽的mRNA高4.23倍。
▲mRNA加帽的两种途径
目前使用帽子类似物与NTP、DNA质粒和RNA聚合酶的共转录加帽形成天然的Cap1结构可以减少整体的处理时间，纯化步骤和所需酶的数量，对于降低mRNA的生产成本以及复杂性来说表现最优，其加帽效率在95%以上，同时可以有效降低mRNA的免疫原性。
帽子类似物是mRNA赛道在专利上卡脖子的原材料之一。目前国际通用的帽子类似物有Clean Cap AG帽子类似物。国内也有初创企业正在对这一材料进行专利上的突破。
2) UTR结构、长度以及调节元件
编码前后的非转译区(UTR)负责调控转译以及蛋白表达，对mRNA的转译效率、半衰期、最高表达水平等数值有影响。转译效率可用来推断相同单位mRNA产生蛋白的速度、半衰期用以推断mRNA能够产生蛋白的时间、表达累计最高水平用以推断每单位mRNA在某一时刻能产生的蛋白量的最高水平。同时，UTR中的GC水平、U水平均会影响mRNA的免疫原性，对mRNA制剂的安全性和能否正常产生蛋白造成影响。UTR需要在DNA质粒建立时包含在序列中，属于序列设计的一部分。
3) 编码序列的修饰
mRNA在进入体内的过程中本身因为可以刺激Toll样受体从而激发人体的免疫反应被降解，而核苷酸类似物的设计可以使这一过程不再被激活。其中较为常见的核苷酸修饰物为尿嘧啶类似物，因为mRNA在转录后由无需模板的尿苷化过程形成3’端的尿苷酸尾，能够被尿苷酸特异性核酸酶Dis3L2识别，引发3’/5’端降解，而尿嘧啶类似物可以避免这种降解。具体的例子包括尿嘧啶转变为假尿嘧啶、N1-甲基假尿嘧啶等。
在Moderna的序列修饰中就将尿嘧啶修改成了1-甲基-假尿苷(1mΨ)，从显著提高了mRNA的稳定性。
▲经过核苷酸类似物修饰的mRNA稳定性提高
▲核苷酸修饰的mRNA对B细胞的刺激水平明显下降
4) 3’端 Ploy(A)尾的设计
Poly(A)尾是在mRNA的3’末端添加的非模板化腺苷，在mRNA的翻译和稳定性中起到了关键作用。此部分的难点是其难以排序和准确测量 Poly(A)尾的长度，传统的观点认为，Poly(A)尾越长保护作用越好，但最新的研究显示，Poly(A)尾的长度会因用于蛋白质表达的细胞类型而异。Kwon等人的研究显示，目前通常使用64-150nt长度的Poly(A)尾来实现最高水平的蛋白质表达。
Poly(A)尾在生成一般采用体外转录期间共转录进行，由此方法生成的 Poly(A)尾的长度具有一致性，所以可进行批量控制。
核酸递送技术
mRNA疫苗发挥作用的过程中涉及到的挑战包括吞噬作用、酶促降解、蛋白质吸收、非特异性免疫的发生以及细胞内化障碍。要解决上述问题，最为关键的就是核酸递送系统的构建。根据William等人的研究显示，目前主要应用的有两种载体，一种是病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等，此方法需要考 虑的是载体病毒的预存免疫情况，而另一种非病毒载体凭借其安全性和减少给药次数等优点逐渐成为主流。
非病毒载体主要优势包括:1)保护核酸防止其降解，并提供多种生物材料选项以克服细胞内化的问题;2)通过表面修饰加强靶向特定的免疫细胞，且可以通过pH敏感材料增强内体逃逸，稳定性更好;3)可以制造鸡尾酒疫苗，增强免 疫协同效应。
非病毒载体包括脂质体纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、无机物纳米颗粒以及多肽类纳米颗粒，最常见的是脂质体纳米颗粒(LNP)。
LNP中的三个结构是实现其递送功能的关键：
1) 由于细胞膜和mRNA均带负电荷会产生排斥反应，LNP的阳离子脂质可以协助mRNA进入细胞膜。但早期的阳离子脂质因为具有一定毒性，所以其递送效果不佳。
2) 可电离脂质分子的应用则实现了LNP技术的突破，它的极性会随pH值变化而改变，在生理pH值下保持中性，在LNP被细胞吞入形成内体后，pH值会降低，可离子化脂质分子会携带正电荷，改变LNP结构促进mRNA释放到细胞基质内完成抗原蛋白翻译。
3) 聚乙二醇修饰的脂质分子可以有效防止LNP聚集，控制LNP大小以及防止LNP最初被人体免疫系统识别。
▲LNP的结构
mRNA制剂生产技术
mRNA疫苗的生产可分为三大阶段，一是DNA原液和模板的构建，二是mRNA原液的制备，三是利用脂质微粒进行包封。
（1） DNA原液和模板的构建
DNA模板的制备和构建开始于质粒构建。通常使用的DNA质粒为环状质粒，质粒上含有设计好的序列模块，其中包括刺突蛋白编码。将环状DNA质粒引入大肠杆菌进行繁殖扩增，提取并纯化DNA质粒，过滤溶液，去除细菌及内毒素等其他物质。利用酶将纯化后的环状DNA质粒切割为链状，进行线性化，并进行质控。将所得溶液分装冷藏，并运送至下一阶段的生产加工场所。辉瑞/BNT的疫苗一般在此阶段生产过程耗时10天，若将质控和运输环节纳入考虑则共耗时约17天。
▲DNA模板的制备
（2） mRNA原液的制备——体外转录IVT
第二阶段的目的是将DNA链转化为mRNA。
上一步制备得到的DNA链与酶和核苷酸混合在容器中，RNA聚合酶(RNA polymerase)会将DNA转录为mRNA。这一步骤被称为体外转录(IVT)。得到mRNA后，经过质量控制和运输到达下一生产环节。
辉瑞/BNT这一阶段的生产耗时约4天，质量控制和运输耗时12天，共16天。
通过一次IVT反应，可以获得500万-1000万剂次的mRNA。
▲mRNA的体外转录
（3） mRNA制剂的包封
第三阶段的流程目的是将mRNA包裹进脂质载体(LNP)中。脂质悬浮于酒精溶液中，与mRNA接触并将其包裹，两种物质通过相反电荷相吸引。之后，原液经过切向流过滤(TFF)滤除溶液中多余的脂质、酒精等杂质，并制成最终的 mRNA疫苗溶液。此生产过程耗时约12天。辉瑞/BNT目前在一家位于密歇根的工厂进行这一阶段的生产，生产场地面积仅相当于一个能容纳一辆汽车的车库大小。场地内有100台微流控装置工作，在30小时内制造了300万剂次的疫苗原液。
此阶段是mRNA制剂生产的最大瓶颈之一，其中一个重要原因是市场上提供脂质的厂商有限，因此辉瑞已开始自主研发制造脂质。但其中涉及的专利等问题仍旧为这一阶段的放大生产蒙上了一层阴影。
4mRNA技术的优势
相对于一般的小分子化药和大分子生物药，以及其他的疫苗技术平台，mRNA具有相当多的优势。
从疾病治疗的层面来讲，与目前的基因疗法和细胞相比，mRNA优势主要体现在两方面：
1) 安全性高：仅在细胞质内表达，无需进入细胞核，效率高且没有整合进基因组的风险，免疫源性低，代谢产物纯天然，没有持续累积毒性的风险；
2) 靶点丰富：很多难成药的蛋白或胞内蛋白均可由 mRNA编码表达，且可 分泌至胞外、靶向受体或循环系统，靶向性选择更加丰富。
从疫苗的层面上来讲，与灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗等疫苗技术平台相比，mRNA疫苗也具有非常明显的优势。
▲mRNA疫苗平台与其他平台对比
5mRNA技术的专利问题初探
LNP作为核酸药物领域应用最为广泛的药物递送技术，以其优良的体内稳定性和成药性被国外的mRNA疫苗研发三巨头(Moderna、CureVac、BioNTech)选为mRNA疫苗的递送载体。目前针对LNP的专利保护主要有3个部分，首先是保护LNP中阳离子脂质的化学结构，也是LNP专利的核心；其次是阳离子脂质与其他成分之间的构成比例，包括不同脂质的比例以及阳离子脂质与mRNA的配比；最后是针对LNP的用途专利。
Arbutus公司是LNP领域的龙头公司，其在阳离子脂质及PEG脂质方面的专利覆盖广泛且深入，除了覆盖众多分子专利外，还包括多种配比专利及应用专利。全球几大mRNA疫苗研发公司Moderna、BioNTech及CureVac都曾向Arbutus寻求LNP的专利授权，同时由于Arbutus专利覆盖的完整性，Moderna此前曾向美国专利商标局申请对于Arbutus部分专利无效化但最终败诉，由此可以看出LNP专利在mRNA药物开发过程中的关键作用。
目前Arbutus在中国主要申请了7项专利，整体专利覆盖领域也较为完善，国产厂商如想使用商业化LNP，一方面可以尝试获得Arbutus的授权，另一方面可以从LNP结构研发入手，打造自主专利壁垒。
▲Arbutus在中国的授权专利
我国mRNA领域整体发展时间较美国稍晚，但发展速度较快，大部分院校及公司基本于2010年以后开始涉足mRNA产业链专利布局，并且从2021年开始走上快车道。
国内企业（上市公司和未上市的Biotech都有）积极投入mRNA新技术研究及专利保护建设。自主知识产权的核苷酸修饰技术、帽子类似物、LNP和mRNA制剂配方等均已有一定的突破，在不远的将来，我们有机会见到全国产化的mRNA药物。
综合来看，国内mRNA企业已具备及时准确专利预警和避开专利壁垒的前期意识，同时凭借自研能力重点考虑布局具有自主知识产权的关键专利技术，在未来mRNA领域竞争中，有望占据更有利的地位。
6 mRNA行业未来可能的发展趋势
1、持续引入新的技术以改善mRNA性能
mRNA固有的免疫原性虽然增强了其作为疫苗的效力，但这也阻碍了其作为疗法的潜力。mRNA疗法需要高水平的蛋白表达以达到治疗效果，在用于酶替代疗法、局部再生疗法和肿瘤免疫疗法的小鼠模型中，通常需要比mRNA疫苗高50-1000倍的使用剂量。对于高蛋白表达水平的需求导致了多种优化mRNA的策略，以最小化免疫反应，增强mRNA稳定性和最大化翻译效率。
对于mRNA疫苗和mRNA疗法来说，最关键的进展或许就是发现对核苷的化学修饰可以显著降低mRNA的免疫原性、增加蛋白质表达水平。这也是迄今为止mRNA领域专利索赔的核心。除了对mRNA进行化学修饰以外，对mRNA序列进行密码子优化，也有望开发出有效的、无需化学修饰的治疗性mRNA。
除了蛋白质表达水平之外，mRNA疗法在治疗慢性疾病时的一个关键限制因素是其蛋白质生产时间较短，因此需要重复给药。目前有几种对mRNA结构的优化以提高其表达蛋白质的持续时间，例如自扩增mRNA（saRNA）和环状mRNA（circRNA）。
2、新型递送系统的优化
目前已上市的和在研的mRNA疫苗/疗法大多使用脂质纳米颗粒（LNP）作为载体，LNP在60多年前被首次提出，此后经历了许多改变和进步，最终首次在临床上用于递送siRNA疗法。LNP由4种关键组分：结构性脂质、胆固醇、阳离子或可电离脂质、隐形脂质。结构性脂类是LNP的基本支架，以不同比例加入胆固醇可稳定LNP结构，并可调节其性质，如膜流动性、弹性和渗透性。阳离子脂质或可电离脂质是将带负电的mRNA装载到LNP所必不可少的。隐形脂质主要是聚乙二醇（PEG）修饰的脂质，它的加入能够降低LNP免疫原性、增加稳定性。但值得注意的是有些人对PEG过敏，这为慢性疾病治疗中的反复给药带来障碍。因此，优化聚乙二醇（PEG）修饰的脂质或开发其他的隐身脂质，是目前的研究重点。
基于细胞、细胞外囊泡和仿生囊泡的其他递送载体正在开发中，并作为替代载体在临床前研究中得到了验证。
LNP的一种替代方法是使用生物递送载体，例如细胞。这种方法是利用细胞旁分泌功能，直接在体外将mRNA合成的蛋白质引入细胞，而不是将mRNA递送到目标细胞。与人工合成的LNP相比，细胞载体具有许多优点，包括更高的生物相容性、更长的循环寿命，以及具有内源性细胞内/细胞间信号转导。细胞被用作药物载体，将酶、治疗药物或脂质颗粒递送到目标部位。
通过将mRNA引入各种可用的细胞类型（例如，免疫细胞、红细胞和间充质细胞）和进一步的基因工程，可以进行广泛的定制。这种方法也可以与现有的细胞疗法结合，以增强治疗效果。然而，基于细胞的mRNA疗法的递送可能受到细胞疗法通常存在的限制，如组织相容性问题、生产问题、繁琐的质量控制，以及细胞内递送能力等等。
3、克服长期给药和重复给药
长期给药的主要问题是如何在多年的每次给药过程中保持蛋白质的稳定生产。大多数慢性蛋白质疗法会随着针对蛋白质或递送载体的抗体的逐渐增加而失去疗效。
在mRNA新冠疫苗接种中，小剂量的LNP-mRNA的局部递送已经可以观察到炎症并发症，而mRNA疗法需要高剂量的长期慢性给药将放大炎症并发症。此外，一些临床前研究显示，在蛋白质替代疗法中，长期使用LNP-mRNA会带来肝毒性。因此，需要在临床前动物模型中精心设计研究方案并详细监测以解决这些问题。
4、拓展疫苗（传染病和肿瘤治疗性疫苗）以外的适应症
尽管mRNA疗法在大型动物以及临床试验中的长期安全性和有效性仍在研究中，但我们已经可以从动物研究和已进行的少量后期临床研究中看出mRNA疗法在近期临床发展的轮廓。
分泌蛋白定位于特定组织，例如肿瘤中，这是一个mRNA疗法可行的机会。在未来几年里，可能会有多种类似于VEGF的旁分泌因子通过局部、组织特异性给药获得临床应用。分泌或细胞内抗体疗法也是一个重要的机会，因为与重组蛋白相比，mRNA可实现大量抗体的长时间生成，还可以快速产生多种治疗性抗体混合物。在细胞内蛋白中，值得注意的机会包括代谢蛋白和线粒体蛋白，这是传统疗法难以解决的问题。
在组织特异性靶向方面，临床研究表明，静脉注射LNP-mRNA能够在肝脏中高表达蛋白质，而直接在肌内注射的裸mRNA可在整个心脏中被摄取和表达。因此，将mRNA直接注射到各种实体器官的新兴递送系统可能会开辟新的靶点和临床适应症。对于需要严格控制蛋白质表达水平和持续时间的疾病，mRNA提供了一种剂量依赖性，能够限制蛋白质长期过表达或脱靶的CRISPR基因编辑的毒副作用，这是基于DNA的基因治疗载体不容易实现的。
除此之外，mRNA疗法还有着许多创新应用，例如通过mRNA短暂表达CXCR40来改善人类造血干细胞移植。以及通过静脉注射LNP-mRNA来实现在体内原位产生CAR-T细胞。mRNA的巨大潜力和多功能性很可能在未来引发更多研究和治疗的新机会。
